Értelmiségi, hagyománytisztelő torinói zsidó család sarja. Apja nem helyeselte, hogy nő létére tanulni és dolgozni akar, ő mégis elérte, hogy orvosnak mehessen. 1936-ban summa cum laude minősítéssel szerzett diplomát, ezután a neurológiára és a pszichiátriára szakosodott, a környéki szöveteknek az idegsejt növekedésére gyakorolt hatását kutatta.

Ígéretes pályafutását a Mussolini-rezsim a zsidók szakmai érvényesülését tiltó törvénye törte derékba, így hálószobájában rendezte be laboratóriumát. (Erről az időszakról ma úgy nyilatkozik, hogy tulajdonképpen köszönettel tartozik az őt alsóbbrendűnek nyilvánító Ducénak, mert így megismerhette a munka igazi élvezetét.)

1943, Olaszország német megszállása után bujkálnia kellett, majd egy menekülttáborban orvosként dolgozott.

A háború után folytathatta kutatásait, s két cikke felkeltette az amerikai St. Louis Washington Egyetem zoológiai tanszékvezetője, Victor Hamburger professzor figyelmét. 1947-ben Levi-Montalcini elfogadta a neki felajánlott amerikai állást - szerződése eredetileg egy szemeszterre szólt, végül mégis 30 évig maradt ott, 1958-tól már maga is professzorként.

1948-ban fölfedezték, hogy az egértumor egy változata csirkeembrióba ültetve serkenti az idegnövekedést, a hatást a tumorban található, általuk idegnövekedési faktornak (NFG) elnevezett anyagnak tulajdonították. Levi-Montalcini kimutatta, hogy a tumor hasonló sejtnövekedést idéz elő laboratóriumban életben tartott szövettenyészetben is.

Az NFG-t Stanley Cohen biokémikus izolálta a tumorból, ez volt az első a számos sejtnövekedési faktor közül, amelyet állatok testében találtak. Az is kiderült, hogy az NFG-t több-kevesebb mennyiségben minden sejt tartalmazza, s felfedezése azt is bizonyította, hogy egyes sejtek által elválasztott anyagok, melyek nem tartoznak az addig ismert hormonok közé, más sejtek addig tisztázatlan mechanizmusú folyamatait befolyásolják. Cohen és Levi-Montalcini felfedezésükért évtizedekkel később, 1986-ban kapták meg a Nobel-díjat.

Levi-Montalcini a Washington Egyetemen, majd a Római Sejtbiológiai Intézetben dolgozott tovább, A tökéletlenség dicsérete című önéletrajza 1988-ban jelent meg. 1987-ben átvehette a Nemzeti Tudományos Érmet, ez a tudományos világ legnagyobb díja az Egyesült Államokban, tagja az amerikai és az olasz tudományos akadémiának, s ő volt a vatikáni pápai tudományos akadémia első nőtagja. 2001-ben az olasz szenátus örökös tagjának nevezték ki, és ma is aktívan részt vesz a felsőház vitáiban.