Az Adriai-tenger partján, Pesaróban, egy, a kosárlabdacsapatáról, s nem a futballistáiról híres kisvárosban született 1977. május 29-én. A Cesena kölyökjátékosa volt, majd 17 évesen a B ligás csapatban játszotta végig az 1994-95-ös szezont.
1995 nyarán a Milanhoz került, november 5-én mutatkozott be az első osztályban, majd további hat bajnokin szerepelt abban az esztendőben a scudettót megnyerő csapatban.
Kölcsönadták, majd visszatért
A következő szezon végén, bár előtte 11 meccsen szerepelt az idény során a középpályás-bőségben tobzódó gárdában, a Milan kölcsönadta a Vicenzának. A piros-fehérekkel nagy meglepetésre az elődöntőig jutott a Kupagyőztesek Európa-kupájában 1998 tavaszán.
Milánóba visszatérve tartotta kitűnő formáját, tevékeny tagja volt az 1999-ben ismét bajnoki címet nyerő "ördögöknek".
Az A válogatottban 2000 februárjában mutatkozott be, részt vett az ezüstéremmel zárt, belga-holland közös rendezésű kontinensbajnokságon.
2001. február 4-én, a Reggina elleni találkozón súlyos térdsérülést szenvedett, keresztszalag-szakadása miatt közel egyéves kihagyásra kényszerült. Ezért lemaradt a 2002-es világbajnokságról.
Sikeres, de szenvedésekkel teli évek
Nehéz évek következtek, Ambrosini nagyon sokat szenvedett sérülései miatt. Játszott ugyan a 2003-as, megnyert BL-döntőben az Old Traffordon (Rui Costa helyére állt be), tagja volt a következő szezonban az olasz bajnokságot megnyerő gárdának, de képességeihez mérten nagyon keveset játszott.
Sérülése miatt maradt le a 2004-es Európa-bajnokságról, s a 2006-os világbajnokságról is. A mostani idényt végre végig tudta játszani. Miután Pirlo és Gattuso ősszel nem játszott csúcsformában, az egész szezont tekintve, Ambrosini volt a csapat legjobb középpályása.
Firenze helyett marad Milánóban
Sőt, fontos gólokat szerzett: a Sampdoria és az Atalanta ellen az ő találata döntött. Nem mellékesen kiválóan futballozott a Bajnokok Ligájában is, a Bayern és a Manchester United elleni mérkőzéseken.
Az angolok ellen az ő átadásából szerezte meg Alberto Gilardino a csapat harmadik gólját. A tavasz elején Ambrosini azt tervezte, hogy a kevés játéklehetőség miatt a nyáron a Fiorentinához szerződik. A BL-elődöntő után azonban megváltoztatta a szándékát, s további két esztendővel, 2010-ig meghosszabbította a szerződését a Milannal.
Ha Paolo Maldini, sérülése miatt, nem tudna játszani az athéni döntőben, Massimo Ambrosini viselné a piros-feketék csapatkapitányi karszalagját.